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熱門關(guān)鍵詞： ELISA試劑盒生化試劑盒胎牛血清重組蛋白移液器 ※本公司產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)研究使用，不用于臨床診斷 !

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ELISA試驗(yàn)常見問題

A1、ELISA試驗(yàn)出現(xiàn)非常弱的結(jié)果，常見有7種原因，其解決方法如下：1)可能原因：溫育的時(shí)間或者溫度不夠；解決方法：校正溫育箱溫度。2)可能原因：顯色反應(yīng)時(shí)間太短；解決方法：校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)。3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題；解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。4)可能原因：加入抗體/酶的稀釋液濃度太低；解決方法：按照說明書保存試劑盒和準(zhǔn)確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密。5)可能原因：酶標(biāo)儀濾光片不正確；解決方法：檢查酶標(biāo)儀使用的濾光片。6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡；解決方法：試劑室溫平衡至少120分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。7)可能原因：不正確的試劑儲(chǔ)存方式；解決方法：按照說明書要求保存試劑盒。2、試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽性對(duì)照不顯色，應(yīng)如何分析和查找原因?答：試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽性對(duì)照不顯色，常見原因如下：a)可能原因：漏加或者誤加試劑；解決方法：檢查試驗(yàn)記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對(duì)標(biāo)簽。b)可能原因：試劑過期；解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品。c)可能原因：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉等);解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。d)可能原因：溫育的時(shí)間或溫度不夠；解決方法：校正溫育箱溫度。e)可能原因：標(biāo)準(zhǔn)品失活或者丟失；解決方法：標(biāo)準(zhǔn)品正確保存、溶解和混勻。f)可能原因：抗體失活或者丟失；解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度。g)可能原因：酶失活或者丟失檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20-100倍，取5uL加入100ul的顯色液A和B混合底物，終止后顯色是否能達(dá)到1.0左右，此為酶的粗略估計(jì)。解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。h)可能原因：顯色底物失活檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。解決辦法：更換顯色底物。3、試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，這是什么原因造成的?答：試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，常見原因如下：a)可能原因：洗板不干凈；解決方法：充分洗滌，徹底拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準(zhǔn)確配制；吸嘴盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。b)可能原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過期；解決方法：檢查試劑盒有效期。c)可能原因：蒸餾水受酶等污染；解決方法：使用新鮮蒸餾水；d)可能原因：試劑混用；解決方法：不同批號(hào)試劑勿混用。e)可能原因：培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)
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做ELISA實(shí)驗(yàn)需要注意哪些問題?

A1、ELISA操作前準(zhǔn)備工作試劑盒的選擇ELISA操作前，應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、選擇適合自己檢測(cè)范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購(gòu)和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作。樣本處理在收集標(biāo)本前需有一個(gè)完整的計(jì)劃，需要清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測(cè)提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測(cè)，對(duì)收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本，及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本，請(qǐng)取材后，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-80℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。2、ELISA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)禁反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準(zhǔn)備，如離心管的準(zhǔn)備和編號(hào)以及稀釋液的準(zhǔn)備；稀釋時(shí)，應(yīng)充分混勻；采用進(jìn)口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。注意：睿信品牌試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品是已倍比稀釋好的，是即用型標(biāo)準(zhǔn)品。3、ELISA操作中的洗滌洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中是最多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果差的現(xiàn)象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機(jī)，嚴(yán)格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實(shí)驗(yàn)誤差和不同實(shí)驗(yàn)之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象，請(qǐng)比照“手工洗板小貼士”操作：a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會(huì)增高。b)特別注意：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要考慮實(shí)驗(yàn)孔的位置，保證甩掉洗液時(shí)，空白孔、低濃度孔或陰性對(duì)照組在上面或一側(cè)或分開最好。同時(shí)注意甩掉洗液的動(dòng)作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補(bǔ)2-3次甩出液體。c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因?yàn)榧?xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會(huì)相差很大。d)每次拍板不要重復(fù)在一個(gè)地方拍，特別是洗去酶的步驟；拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會(huì)對(duì)蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要扣干凈。e)不能減少洗液體積、洗板時(shí)間和次數(shù)。洗板時(shí)間太短，洗板效果不佳。延長(zhǎng)洗板時(shí)間和增加洗板次數(shù)可以使
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ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

A1、固相載體選擇聚苯乙烯：具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。2、包被①板孔的選擇：ELISA級(jí)別的微孔板；②抗體選擇：選擇支持ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體，根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索最適濃度；③包被緩沖液：pH7.2磷酸鹽緩沖液；④包被溫度：2-8℃過夜包被或室溫(37℃)包被2h;⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為1ug/ml-2ug/ml3、封閉①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體);②選擇效果較好的封閉劑(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA、Tween等)。4、加樣及孵育①加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡；②孵育的時(shí)間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm,轉(zhuǎn)速在500±50rpm;③檢測(cè)抗體、酶標(biāo)物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴(yán)格根據(jù)說明書提示；④洗板對(duì)于ELISA來說，是極其關(guān)鍵的一步，保證ELISA的特異性；⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、顯色和終止①使用前需檢查，底物在加入96孔板之前應(yīng)為無色透明；②顯色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免污染；③孵育時(shí)間，說明書上為參考范圍，具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件自行摸索�？蓞⒖紭�(biāo)曲濃度最大孔的顏色，變?yōu)樗{(lán)色較明顯時(shí)即可。

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